Conduta para sequenciamento Sanger no LGCM
Sigam as instruções abaixo para poder efetuar o sequenciamento (Sanger Sequencing) no laboratório.
Preparo de amostra para Sanger Sequencing
Para sequenciamento de amostras no LGCM devem ser seguidas as seguintes regras:
Amostras de PCR devem ser corridas previamente em gel de agarose.
(Não sequenciar amostras com bandas inespecíficas ou com intensidade muito fraca).
Siga o exemplo abaixo:
Purificação das amostras de DNA com Exosap:
– 5uL do produto de PCR
– 2 uL de Exosap
– Ciclagem
37°C – 15 minutos
80°C – 15 minutos
Adicionar em cada well da placa especifica de sequenciamento ou tubo 0,2 mL o seguinte protocolo:
– 2,5 uL do fragmento previamente purificado com Exosap
– 2,5 uL de primer F
ou R (5 uM)
* Os primers para Sequenciamento devem ser diluídos na concentração de 5uM. O ideal é que os primers sejam recém diluídos. Não recomendamos que utilizem os primers de uso do dia a dia (em geral a 10uM ou 20uM) para fazer a diluição do primer para sequenciamento.
* Em caso de placa, deixar um well vazio para controle interno da reação.
Entrega das amostras:
– Preencher a planilha localizada no suporte localizado em cima do computador do sequenciador, indicando a data que a placa foi entregue, quantidade de amostras, tamanho do maior fragmento entre as amostras e nome do responsável.
– Deixar a placa ou os tubos 0,2 mL em rack identificados na gaveta sequenciamento localizada dentro do freezer 7.
– O mapa deve estar com o nome do responsável e preenchido
conforme foram deixados na rack ou na placa.
– Deixar o mapa também no suporte localizado em cima do computador do sequenciador.
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